作者解读丨浙江省农科院: 蔬菜废弃物堆肥优化及堆肥过程中真菌群落相关微生物机制的探索(国人佳作)

  本研究根据结果得出，猪粪与微生物菌剂联合添加是一种成本较低的堆肥方法，可推荐用于VWS中试堆肥。

  应用添加剂调节堆肥过程中微生物功能组成的研究已引起广泛关注。然而，关于真菌群落在添加猪粪和微生物菌剂的蔬菜废弃物实验室规模堆肥中的演替和作用知之甚少。

  本研究旨在发现可以轻松又有效改善蔬菜废弃物堆肥性能和产品质量的添加剂，并分析堆肥过程中微生物群落的演替。

  结果表明，猪粪和微生物菌剂联合添加(T2处理)加速了堆体温度的升高，提高了总有机碳的降解率(23.36%)，促进了堆肥腐熟。

  此外，T2处理提高了大多数酶的活性，重塑了微生物群落，并降低了潜在动物(1.60%)和植物(0.095%)病原体的相对丰度。在高温期，在猪粪和微生物菌剂的联合添加下，厚壁菌门的相对丰度增加(71.23%)。

  网络分析表明，T2处理下真菌网络的复杂性和稳定能力显著提升，确定Saccharomonospora、Aspergillus和Microascus为关键类群。与胞外酶相关的关键类群对堆肥成熟有重要贡献。

  堆肥初期，所有处理的堆体温度都急剧上升。在最初的2-9天内达到高温期(温度大于50℃)，并维持至少15天以杀死病原微生物(补充图S1a)。

  CK和T1处理的峰值温度分别为66℃(第5天)和69℃(第9天)，T2处理在第2天达到峰值69℃。

  此外，在整个堆肥过程中，T2处理的高温期(平均温度超过60℃)持续了14天，而其他处理仅持续了6天。前期研究也表明，接种微生物菌剂能够在一定程度上促进农业秸秆废弃物与畜粪堆肥过程中高温阶段的微生物活性和代谢，加速可利用有机质的降解，进而延长高温期。此外，由于在堆肥过程中补充了水分，所有处理都进入了第二个高温期。

  CK、T1、T2处理的EC值从第0天到第5天(补充图S1b)逐渐升高。这种增加是由于堆肥初期有机物迅速分解，产生大量阴离子和阳离子，从而增加了EC值。然而，在堆肥的第9天，T2处理的EC值明显低于CK和T1处理。

  这表明活性微生物在高温阶段能利用更多的营养离子，导致T2中营养离子较少，这与Song等人的研究结果一致。 所

  通过维持激活嗜热微生物菌剂的有利环境条件，导致堆肥中有机质的矿化，T2中的TOC降低幅度更大。

  CK和T1在第9天和第45天的C/N比以及T2在第16天的C/N比略有升高(补充图S1d)，这表明TN流失速率快于有机质的流失速率。尤其是在堆肥结束时，T1和T2中的C/N比均低于CK。

  这可能是由于猪粪和微生物菌剂的添加有助于提高代谢率，加速了堆肥过程中的碳氮转化。保持适当的C/N比通常有助于堆肥工艺的优化和改进，推荐的C/N比通常在20-35之间。但

  在本研究中，所有处理的C/N比均接近20(表1)，T2处理明显提高了堆肥腐熟率，而CK和T1的堆肥过程不是很有效。

  因此，猪粪和微生物菌剂的添加不仅平衡了C/N，而且为改良堆肥提供了额外的微生物。

  CK和T1处理的TP含量在堆肥过程中逐渐增加，而T2处理的TP含量变化不同。

  T2处理的TP含量在中温阶段和高温阶段逐渐升高，第9-16天逐渐下降，最后在冷却阶段趋于稳定。在堆肥过程中，各种形态的磷可以在功能微生物的作用下发生转化。例如，T2中大量的特定磷可能被用于微生物生长，以此来降低了该处理的TP含量。

  此外，与CK和T1相比，新鲜猪粪与微生物菌剂联合添加(T2)明显提高了第0-38天TP的累积量(0.91-1.41%)。

  TK含量在堆肥过程中呈增加趋势，在CK、T1和T2处理中，TK含量分别从2.8%增加到3.4%、3.5%和3.6%。

  堆肥初期，易降解有机物的快速降解产生了大量气体，减少了堆体干物质质量，使得TP和TK相对含量增加。此外，T2中Thermobifida的相对高丰度可能有助于提高堆肥中后期的TP和TK含量。

  第2天CK、T1和T2处理的GI值分别为54.50%、58.23%和56.90%。由于低分子量挥发性脂肪酸和氨的产生，部分处理的GI值在堆肥过程中下降。

  此外，GI高于60%表明堆肥成熟。根据结果得出，T2(69.37%)和CK(67.20%)在第23天成熟，T1(62.60%)在第38天成熟。因此，联合处理T2有效促进了堆肥的成熟。与其他处理相比，堆肥结束时T2处理的GI值也较高(73.94%)。所有处理的堆密度均呈增加趋势(补充图S1h)。

  如图1a所示，CK、T1和T2处理的脲酶活性最大值出现在第2天，分别为3.25、4.05和2.82 mg·g-1·d-1，而在四个采样点的T2中观察到更高的活性。

  此外，所有处理的UR变化均呈急剧下降趋势，这可能与堆肥后期有机质和水溶性氮含量较低有关。

  然而，本研究结果与先前文献报道的番茄秸秆、大白菜尾叶和鸡粪共堆肥过程中UR明显地增加不一致。这种差异可能是由于堆肥物料的不同影响了UR的变化。

  蛋白酶活性在所有处理中均有波动(图1b)，堆肥处理和取样时间均对PT有显著影响。总体而言，T2处理从第16天到第45天PT增强，活性在第38天增加到峰值(6.37 mg·g-1·d-1)。但

  猪粪的添加可能为微生物提供了丰富的可利用氮素。接种微生物菌剂促进了功能微生物的生长，这些功能微生物与蛋白质的活性降解紧密关联，并在适应了高温期和成熟期的堆肥环境后刺激产生了更高的PT。

  不同处理的纤维素酶活性在前10天从始至终保持较高水平。随后，CL逐渐下降，直至堆肥结束(图1c)。

  此外，从第9天到第23天，T1和T2处理的纤维素酶活性显著高于CK，而T1和T2之间无显著差异。

  总体而言，从第0天到第5天，T2处理的纤维素酶活性迅速增加，这与堆肥初期在较高温度下观察到的较高CL相一致。

  由此推断，猪粪的添加提供了丰富的可降解有机物，并改变了堆肥初期的养分，这可能导致了微生物菌剂的快速增繁，并通过维持原生和外源纤维素分解微生物之间的协同共生来刺激产生更多的纤维素酶。

  表1 堆肥处理(CT)、取样时间(ST)及其交互作用对堆肥过程中胞外酶活性影响的双因素方差分析。（原表2）

  注：统计学显著差异P0.05(加粗)。UR：脲酶活性；PT：蛋白酶活性；CL：纤维素酶活性；AL：淀粉酶活性；PPO：多酚氧化酶活性；NS：不显著(P0.05)。

  图1 不同处理堆肥过程中脲酶(a)、蛋白酶(b)、纤维素酶(c)、淀粉酶(d)和多酚氧化酶(e)酶活性的动态变化。

  CK：蔬菜废弃物秸秆自然堆肥(对照)；T1：添加新鲜猪粪；T2：新鲜猪粪和微生物菌剂联合添加。值为三次重复的平均值，误差线为标准差。

  淀粉酶与多糖、寡糖和单糖的矿化有很强的相关性。结果表明，堆肥处理对淀粉酶无显著影响，但取样时间及其交互作用对淀粉酶有显著影响。

  此外，在整个堆肥过程中，观察到不同处理的AL均呈下降趋势(图1d)。其中，T2处理的AL峰值出现在第9天(2.99 mg·g-1·d-1)，其次是第5天的CK处理(2.85 mg·g-1·d-1)和第5天的T1处理(2.39 mg·g-1·d-1)。

  这可能是由于堆体中总有机碳含量和总氮含量的差异影响了AL的水平。 多酚氧化酶在芳香族化合物的催化氧化和易降解中间物质的生成中起着重要作用。

  此外，如图1e所示，除CK外，不同堆体的多酚氧化酶谱存在3个峰值(在第5、16和38天)。

  T2处理的PPO在堆肥的大部分阶段显著高于其他处理，变化范围为12.27 - 20.77 mg·g-1·d-1。

  值得注意的是，从第2天到第5天和从第23天到第38天，多酚氧化酶的快速增加可能是由于真菌自溶引起的，这有助于改善T2中这些阶段的腐殖化过程。

  综上所述，试验表明，猪粪和微生物菌剂的联合添加显著提高了大多数酶的活性。

  众所周知，堆肥体系中酶活性的变化取决于底物的浓度、有机物料的进一步降解以及竞争性抑制剂的存在。

  不同的微生物群落对酶活性具有独特的贡献，但关于不同添加剂对蔬菜废弃物堆肥过程中微生物群落与功能酶活性之间相关性的影响的数据仍有限。

  总体而言，细菌是最丰富的可培养微生物，其次是放线a，c，e)。其中，CK、T1和T2处理的细菌数量最高(以CFU g-1干堆肥表示)，分别为1.8×109(第23天)、2.0×109(第38天)和1.1×109(第45天)。此外，由于添加了猪粪，在第0天，T2的可培养细菌数量比CK增加更多。

  堆体温度的变化通常是可培养细菌数量变化的主要原因；然而，这种影响并不显著。放线在堆肥过程中始终保持比较高的可培养放线菌数量。

  在高温期，温度与可培养放线菌数量显著相关。此外，在堆肥过程中，T2处理中也观察到较高的可培养线)，而温度与这些真菌不显著相关。

  尽管这一结果与之前发表的结果一致，但在T2处理的第2天，较高温度的选择压力可能限制了大多数真菌的繁殖。

  先前的研究还表明，放线菌和一些具有强大功能酶系统的真菌物种是重要的木质纤维素降解菌。

  因此，可培养放线菌和真菌的增加增强了微生物活性，提高了VWS的降解速率，并提高了联合处理下的堆肥温度。

  不同处理中微生物多样性的演化所有样本的细菌群落共获得1,261,712条序列，聚类为1894个OTUs。

  从堆肥样品中获得了1,505,802条线个OTUs。测定每个样品中微生物的多样性(Shannon)和丰富度(Chao1)。对于细菌而言，在第2天，T1和T2的Shannon指数值明显高于CK，但两者之间差异不显著。

  值得注意的是，猪粪和微生物菌剂的联合添加(T2)显著降低了堆肥中后期的Shannon指数。但

  堆肥过程有效降低了T1和T2的细菌Chao1指数，这与CK处理的结果不同。对于线的Shannon和Chao1指数最初较高，随后下降，这也与CK处理的结果不同。

  通过NMDS评估了不同样品中细菌群落组成的相似性(图2a)。在本研究中，证实了处理和堆肥阶段对细菌群落的分布有显著影响。

  在堆肥中后期，CK和T1的细菌群落组成相似。但在第2天，外源添加剂导致所有堆体中的细菌群落结构明显分离。

  此外，T2中的细菌群落在后期OTU水平上出现了很大变化，这可能是由于堆肥环境和养分有效性的差异。

  同样，在第2天，所有样品的真菌群落组成也出现显著差异(图2b)。T2处理的线天与其他处理有显著差异，但在第38天与其他处理之间有较高的相似性。

  需要进一步的分析来确定堆肥代谢过程中与功能酶活性相关的微生物类群的差异，这对于开发高效堆肥的潜在微生物资源至关重要。

  图2 基于Bray-Curtis距离，在操作分类单元(OTUs)水平上对堆肥中细菌(e)和真菌(f)群落丰度进行非度量多维尺度分析(NMDS)。

  CK：蔬菜废弃物秸秆自然堆肥(对照)；T1：添加新鲜猪粪；T2：新鲜猪粪和微生物菌剂联合添加。符号表示处理：CK(圆圈)、T1(正方形)和T2(三角形)。不同的颜色代表不同的日期(第2、23、38天)。

  在堆肥过程中监测了细菌群落结构的变化。细菌群落在门水平上的相对丰度显示在补充图S4中。不同处理中存在5个优势细菌门，包括厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门。

  许多厚壁菌门物种可以参与一系列的代谢能反应，包括碳水化合物的吸附和纤维素的降解。

  因此，T2处理优化了堆体中的营养环境，促进了堆体堆肥前期该菌门的相对丰度，提高了堆体温度。然而，厚壁菌门的相对丰度随堆肥时间的增加而显著降低，而绿弯菌门和拟杆菌门的相对丰度则急剧增加。

  此外，在堆肥中后期，T2处理中放线%)高于其他处理。丰度较高的耐热放线菌通过产生酶和分泌抗生素在降解有机组分和杀灭病原微生物方面发挥作用，有助于后期消除堆体的生物毒性。

  在早期阶段，芽孢杆菌属(Bacillus)是绝对优势属，在所有处理中的种群数量为19.98-21.66%(图3a)。Bacillus的相对丰度不受添加剂的影响。

  有研究报道，Staphylococcus参与腐殖质组分的转化，提高可提取态钾含量的积累。

  据报道，Saccharomonospora和Clostridium在酚类化合物水解、木质纤维素降解和腐殖质转化方面表现出优异的性能，所有这些都有助于改善堆肥过程。

  此外，Membranicola和Actinomadura与有机质的有效降解密切相关，并促进胡敏酸与富里酸比值的稳定增加。

  这些根据结果得出，猪粪和微生物菌剂的联合添加可能有助于堆肥过程中有机质的降解。 所有处理中丰度最高的3个真菌门分别为子囊菌门、担子菌门和unclassified_k_Fungi。

  值得注意的是，猪粪和微生物菌剂的联合添加显著降低了unclassified_k_Fungi的相对丰度，在第23天和第38天分别为0.26%和0.37%。

  T2处理在第23天明显提高了Pichia的相对丰度(1.42%)，降低了Acremonium的相对丰度(39.63%)。这些数据表明T2处理优化了真菌群落结构。

  例如，Aspergillus在木质纤维素降解中起关键作用，而Pichia具有很强的降解有机酸的能力。这些菌属在第23天结束时共同促进了堆肥进程。在第38天，所有处理中最丰富的菌属为Acremonium(76.31-97.31%)。

  然而，Acremonium的一些单个物种和大多数unclassified_k_Fungi物种都是病原微生物。这些结果表明，相关菌属的丰度变化有助于提高T2后期堆肥产物的安全性。

  人类病原体相对丰度的变化(c)由Tax4fun的1级KEGG直系同源功能预测注释，植物病原体相对丰度的变化(d)由FUNGuild预测。

  基于前30个细菌(e)和真菌(f)属，冗余分析揭示了不同处理(CK、T1和T2)在不同日期(2、23、38天)的堆肥样品与环境因子(红色箭头)之间的关系。

  将前30个微生物属的平均相对丰度转化为对数值(n=3)在热图中以不同颜色(红色表示丰度高)显示。

  图例：EC，电导率；C/N，总有机碳与总氮的比值；TP，总磷；GI，发芽指数；UR，脲酶活性；PT，蛋白酶活性；CL，纤维素酶活性；AL，淀粉酶活性；PPO、多酚氧化酶活性。

  CK，蔬菜废弃物秸秆自然堆肥(对照)；T1，添加新鲜猪粪；T2，新鲜猪粪和微生物菌剂联合添加。

  通过Tax4fun(细菌)和FUNGuild(真菌)软件预测堆肥过程中不同处理潜在病原菌的相对丰度(图3c-d)。

  根据KEGG功能预测，与其他处理相比，T2在第2天检测到与人类病原体相关的序列的相对丰度最高(2.10%)(图3c)，但该处理在第38天时它们的丰度明显降低(1.60%)。

  根据结果得出，堆肥后T2处理的植物病原菌相对丰度(0.095%)低于CK和T1处理(分别为0.207%和0.110%)。

  因此，上述根据结果得出，猪粪与微生物菌剂的联合添加是降低微生物病原菌数量和最终产物植物毒性的有效途径。

  通过LEfSe分析，以确定所有样本中存在显著差异的代表性群体。当LDA得分大于4.5时，共鉴定出23种细菌生物标志物和18种真菌生物标志物。

  这说明微生物菌剂的添加可以提高高温阶段生物标志物的数量。据报道，厚壁菌门在木质纤维素降解和有机物矿化中发挥重要作用。

  Aspergillus能促进堆肥物料中木质纤维素等难降解物质的快速分解。

  放线菌有助于促进堆肥腐熟度。本研究根据结果得出，外源添加剂(猪粪和微生物菌剂)作为一种选择力，能够驱动微生物群落的演替，增加木质纤维素降解菌的数量。

  尽管污水污泥堆肥中酶活性与各种细菌群落之间的关系已被研究，但有关VWS堆肥中酶活性与真菌群落之间关系的详细信息尚未见报道。

  通过冗余分析确定了本研究中主要环境因子、酶活性和微生物群落组成之间的关系(图3e-f)。

  因此，C/N被确认为堆肥过程中对微生物群落影响最大的因子，这与Qiao等人报道的类似结果一致。

  如图3e所示，在第2天，收集所有堆体的样本，其细菌群落与较高的UR、C/N和T的相关性最为密切。

  在第23和第38天，T2中的细菌群落与TP的相关性最强，而不同处理下的细菌群落存在非常明显差异，这突出了添加剂对细菌群落演替的重要影响(图3e)。

  如图3f所示，CK堆肥样品在堆肥过程中聚为一组，与EC呈显著正相关。在第2天，T2的真菌群落与温度和PPO相关性最大。

  如前所述，动物粪便的添加为微生物制剂提供了更容易代谢的底物。T2中碳化合物的存在可能会影响这些堆肥微生物的生理机能，提高与功能微生物的协同作用，提高代谢活性和堆肥温度。

  微生物种群的差异是由对环境底物代谢偏好的变化引起的。不同的优势微生物可能被分配在功能不同的生态位和营养类群中。

  共现网络分析关注微生物类群与环境因子之间的关联，可用于识别共享生态位中的模块模式和关键物种。因此，确定可能在提高VWS堆肥效率方面发挥关键作用的潜在关键类群具有重要意义。

  本研究通过网络分析来评估堆肥样品中优势微生物OTUs与酶活性之间的关系(图4)。然后选取与酶活性直接相关的细菌和真菌OTUs进行网络可视化(图4a-f)。

  如图4a-c所示，根据结果得出，CK、T1和T2处理的细菌网络分别包含68、99和81个显著关联，除T1外，大部分为负关联。

  如图4d-f所示，根据结果得出，CK、T1和T2处理的线个显著关联，除CK外，大部分为正关联。

  此外，T1和T2处理的网络平均度均高于CK，尤其是添加猪粪和微生物菌剂，增加了真菌网络的复杂性。根据T2的中介中心性，隶属于子囊菌门的OTU592(Aspergillus)和OTU508(Microascus)被鉴定为关键类群。

  此外，目前关于Microascus参与有机物降解的研究尚未见报道。因此，猪粪和微生物菌剂的联合添加可能改变了功能微生物的演替，特别是真菌关键类群的数量。

  这些关键种群对环境限制因素的抗性较强，分泌更高水平的功能酶，并协同促进蔬菜废物堆肥中的养分转化。

  图4 网络分析揭示了CK(a和d)、T1(b和e)和T2(c和f)处理中优势细菌(a, b和c)和真菌(d，e和f)操作分类单元(OTUs)与酶活性之间的关系。

  实线和虚线分别表示强正线)和强负线)关系。彩色节点表示分配给主要门和酶活性的相应OTUs。

  CK：蔬菜废弃物秸秆自然堆肥(对照)；T1：添加新鲜猪粪；T2：新鲜猪粪和微生物菌剂联合添加。

  UR，脲酶活性；PT，蛋白酶活性；CL，纤维素酶活性；AL，淀粉酶活性；PPO,多酚氧化酶活性。

  经济分析为了充分利用猪粪，本研究评估了T1和T2处理(补充图S5)整个堆肥过程的经济成本。

  根据GI值(补充图S1)，T2处理(约23天)生产腐熟堆肥所需时间比T1处理(约38天)短。

  相应地，T2的总成本为97.76美元/吨，较T1(105.97美元/吨)降低了7.75%。因此，T2处理具有较好的商业化应用潜力。

  本研究根据结果得出，应通过盆栽试验和田间试验进一步评估堆肥对土传病害的生物防治效果，探究不同堆肥产品施用量对退化土壤的年际效应。

  本研究首次探讨了蔬菜废弃物堆肥中猪粪与微生物菌剂联合添加对胞外酶活性与真菌群落关系的影响机制。

  根据结果得出，酶和微生物特性直接解释了蔬菜废弃物的快速分解。此外，猪粪和微生物菌剂的联合添加改善了微生物群落组成，提高了木质纤维素降解菌(Aspergillus和Thermomyces)的相对丰度，并形成更稳定的真菌网络。

  本研究根据结果得出，猪粪与微生物菌剂联合添加是一种成本较低的堆肥方法，可推荐用于VWS中试堆肥。